舒筋健腰丸对坐骨神经痛大鼠坐骨神经组织及血清细胞因子的影响

神经病理性疼痛是由外力损伤或疾病侵袭神经系统引起的复杂慢性疼痛。持续的神经痛可影响患者的生理和精神状态,导致患者出现抑郁和焦虑等情绪障碍,严重时可导致患者出现自杀倾向,对社会的危害极其严重 [1-2] 。 迄今为止,神经痛的发病机制仍不清楚,研究神经痛的发病机制和开发有效的治疗方法是目前迫切需要解决的问题。慢性压迫性坐骨神经损伤( CCI )模型能模拟神经痛部分临床症状,可用于神经痛发病机制的研究和治疗神经痛的药物筛选 [3-4] 。目前,针对神经痛的治疗,仍以非甾体抗炎药( NSAIDs )、抗抑郁药或吗啡类药物为主,仅对部分患者有效,但是存在副作用大的缺点。 中医药是我国传统医学的瑰宝,在治疗一些慢性复杂疾病方面具有独特的优势 [5-8] 。舒筋健腰丸是陈李济药厂的独家中药品种,具有补益肝肾,强健筋骨,驱风除湿,活络止痛的功效。多年来临床用于治疗坐骨神经痛,效果良好。据报道,舒筋健腰丸具有较好的抗炎镇痛作用 [9-10] ,但是

舒筋健腰丸对 CCI 诱导的神经痛是否具有缓解作用,仍需要进一步的研究。本研究拟建立大鼠 CCI 神经痛模型,采用行为学、 ELISA 、 HE 染色等方法,考察舒筋健腰丸对大鼠神经痛的影响,并通过与已上市药品进行比较,为临床研究与应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物

112 只 SD 大鼠( 180~220 g ), SPF 级,雄性, 4 周龄,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。 实验动物合格证号: SCXK (湘) 2013-0004 ;饲养环境:每天12 h 照明 /12 h 黑暗交替,温度( 24±2 ) ℃ ,相对湿度50%~60% ,自由摄食和饮水。 动物实验的操作步骤均得到广州医药研究总院有限公司药物非临床评价研究中心动物伦理委员会的批准。

1.2 药品及试剂

舒筋健腰丸粉(批号: 16330 ),广州白云山陈李济药厂有限公司;壮骨关节丸(批号: 1511003S ),华润三九医药股份有限公司;芬必得酚咖片(批号: 16010448 ),中美天津史克制药有限公司;戊巴比妥钠(批号:120505 ),德国默克公司;肿瘤坏死因子 α ( TNF-α ,批号: E-EL-R0019c )、白介素 -1β ( IL-1β ,批号: E-EL-R0012c )、白介素 -6 ( IL-6 ,批号: E-EL-R0015c )、前列腺素 E 2 ( PGE 2 ,批号: E-EL-R0034c ) ELISA 检测试剂盒,武汉伊莱瑞特生物科技有限公司。

1.3 仪器

Elx800 酶标仪,美国 Bio Tek 公司; BX53 生物显微镜和 DP73 荧光显微镜, CellSens Standard 病理图像分析系统,日本 Olympus 公司; 3-18k 高速冷冻离心机,德国 Sigma 公司; ASP 300 全密封自动脱水机,德国 Leica公司; SW-CJ-2FD 净化工作台,苏州净化设备有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠 CCI 模型制备及给药

适应性喂养 1 周后,将 112 只 SD 大鼠按照体重随机分为假手术组和造模组,其中假手术组 16 只,其余动物皆为造模组,参照文献 [11] 描述的方法,制备 CCI 模型。 每只动物均给予 2% 戊巴比妥钠( 3 mL/kg )麻醉,麻醉后剃去动物右下肢皮肤的毛,麻醉动物俯卧位固定,碘酒消毒,剪开右下肢皮肤,逐层分离皮下脂肪、浅筋膜,钝性分离股二头肌,使坐骨神经主干暴露在视野内,用玻璃分针挑出坐骨神经主干,对其进行 4 道结扎(结扎线采用 4-0 医用羊肠线),每道结扎的间距约为 1 mm(结扎程度以切口暴露周围的肌肉产生轻微、短暂的抽搐为准),用 0.9% 氯化钠注射液冲洗切口,结扎后对肌肉和皮肤逐层进行缝合,缝合前后均在伤口处给予 0.2 mL 的青霉素钠注射液,以防感染。 假手术组动物仅暴露坐骨神经但不结扎,其余操作方法与上述描述相同。 造模第 7 d 对动物进行机械刺激回缩反应测定,与造模前相比,出现明显回缩反应的动物即为造模成功的动物,可进行后续实验,否则就从整体实验中剔除。 所有模型大鼠动物均造模成功,将模型大鼠随机分为模型组 ( 0.5% CMC-Na 溶液), 壮骨关节丸组,芬必得酚咖片组,舒筋健腰丸高、中、低剂量组,每组 16 只。造模第 8 天开始对各组动物进行灌胃给药,除芬必得酚咖片组动物连续给药 5 d ,间隔 2 d 给药1 次外,余下各组动物均每天 1 次,连续给药 28 d (各

组动物的给药体积均为 10 mL/kg )。

1.4.2 热痛觉过敏测定

将大鼠放入辐射热刺痛仪的有机玻璃格子中,安静环境中适应 20 min 后,用强光照射大鼠脚掌中部皮肤,测定大鼠的缩爪潜伏期,每隔 10 min 测 1 次, 取 3 次测定结果的平均值作为测定结果。 为防止大鼠脚底被热辐射烫伤,将潜伏期的上限值定为 30 s 。

1.4.3 标本采集与病理检查

用 20% 乌来糖皮下注射麻醉,采用腹主动脉采血 5 mL , 3000 r/min 离心15 min 取上层血清, -20℃ 保存待测。 坐骨神经标本的处理:每组选取 8 只,于大鼠造模侧损伤部位神经取两段组织,分别为结扎区域及距离结扎区域 2.5～3.0 cm 的结扎神经,放入 10% 甲醛溶液固定,经脱水、常规石蜡包埋制片及 HE 染色封片,光镜检查。组织学改变程度用 - 、 + 、 ++ 、 +++ 表示正常、轻度、中度和重度。 水肿发生率 = 出现水肿例数 / 总动物数 ×100% ,空泡变性发生率 = 出现空泡变性例数 / 总动物数 ×100% 。

1.4.4 细胞因子的检测

采用 ELISA 试剂盒,按照试剂盒说明书进行操作,检测各组大鼠血清中 TNF-α 、 IL-1β 、 IL-6 、 PGE 2 的水平。

1.5 统计学方法

采用 SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数 ± 标准差( x±s )表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用 Student-t 检验;计数资料用率表示,等级资料比较采用秩和检验,以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 舒筋健腰丸对 CCI 模型大鼠缩爪潜伏期的影响

与假手术组相比,模型组动物的缩爪潜伏期显著缩短,差异有统计学意义( P < 0.05 )。 与模型组相比,舒筋健腰丸高、中、低剂量组可以显著延长模型大鼠的缩爪潜伏期,而且高剂量组的效果优于中剂量组和低剂量组( P < 0.05 )。见表

2.2 舒筋健腰丸对 CCI 模型大鼠坐骨神经组织病理改变的影响

假手术组动物坐骨神经周围间质及神经纤维结构完整,排列整齐,未见异常变化;与假手术组相比, 模型组动物均可见细胞质内可见多数空泡,细胞核排列不规则,并可见许多肥大细胞,为坐骨神经空泡变性(图 1 )。 与模型组比较,壮骨关节丸组、芬必得酚咖片组、舒筋健腰丸高剂量组、中剂量组、低剂量组坐骨神经水肿、空泡变性程度降低( P < 0.05 )。见表 2 。

注: - :正常; + :轻度; ++ :中度; +++ :重度; -- :无数据

A :假手术组; B :模型组; C :壮骨关节丸组; D :芬必得酚咖片组; E :舒筋健腰丸高剂量组; F :舒筋健腰丸中剂量组; G :舒筋健腰丸低剂量组;黑色箭头所指为空泡样变性

图 1 舒筋健腰丸对大鼠坐骨神经病理改变的影响( HE 染色, 100× )

2.3 舒筋健腰丸对 CCI 模型大鼠血清炎性因子的影响

结果显示,与假手术组相比,模型组动物血清中IL-lβ 、 IL-6 、 TNF-α 和 PGE 2 含量显著升高( P < 0.05 );与模型组比较,壮骨关节丸组、芬必得酚咖片组、舒筋健腰丸高、中剂量组 IL-lβ 和 IL-6 含量均有不同程度的下降 ( P < 0.05 ); TNF-α 、 PGE 2 差异无统计学意义( P > 0.05 )。 其中,舒筋健腰丸高剂量组 IL-lβ 和 IL-6含量低于中低剂量组( P < 0.05 )。 见图 2 。

与假手术组比较, # P < 0.05 ;与模型组比较, * P < 0.05 ;与舒筋健腰丸高剂量组比较, ▲ P < 0.05

图 2 舒筋健腰丸对大鼠血清炎性因子的影响( n=8 )

3 讨论

神经病理性疼痛是一种临床常见的慢性疼痛,其在人群中的发病率约为 7% ,中国约有 1600 万例神经病理性疼痛患者。 患者常伴有抑郁、焦虑和睡眠障碍等症状,严重影响患者的生活质量,也给患者的家庭和社会带来巨大的经济负担 [12-13] 。因此,寻找治疗神经病理性疼痛的药物受到越来越多的关注。 CCI 是一种周围神经损伤导致神经痛的经典模型,与其他模型相比,具有显著的痛觉过敏现象,症状可持续 8 周以上 [14] 。 本研究选用 CCI 大鼠模型来研究舒筋健腰丸对神经痛的作用。结果显示,在热痛觉过敏测定中,舒筋健腰丸可延长 CCI 模型大鼠的缩爪潜伏期,改善大鼠的痛觉过敏行为,并呈现一定的量效关系。

周围神经损伤后, 伤害性刺激从外周传入中枢,胶质细胞上的危险相关分子模式感知这些信息后会引起胶质细胞激活并释放大量的促炎性细胞因子如IL-lβ 和 TNF-α 等,导致脊髓内发生炎性反应 [15-16] ;神经炎性反应使传递痛觉的神经元兴奋,促进中枢敏化形成,在行为上则表现为痛觉过敏等现象 [17-18] 。外源性给予 IL-lβ 可诱导大鼠出现明显的热痛过敏 [19] ,而阻断中枢的 IL-lβ 信号可以缓解周围神经损伤引起的神经痛 [20] 。 因此,神经炎性反应在神经病理性痛的形成中起着关键作用。 在本研究中,模型组与假手术组相比,血清内 IL-lβ 、 IL-6 、 TNF-α 和 PGE 2 水平明显升高( P < 0.05 )。而与模型组相比,给予舒筋健腰丸 28 d可以显著降低模型大鼠血清内 IL-lβ 和 IL-6 水平( P < 0.05 ),虽也能降低 TNF -α 和 PGE 2 的水平,差异无统计学意义( P > 0.05 )。 对大鼠坐骨神经组织的病理学检查也发现,连续 28 d 给予舒筋健腰丸可减轻 CCI引起的神经水肿和空泡变性等现象,从而发挥保护坐骨神经的作用。

综上所述,舒筋健腰丸能明显缓解 CCI 模型大鼠坐骨神经组织的病理变化,降低血清内炎性因子的含量,从而改善模型大鼠的热痛过敏行为。 提示舒筋健腰丸对坐骨神经痛具有明确的治疗作用。在后续的实验中,将进一步研究其具体的作用靶点,为舒筋健腰丸临床的应用提供科学依据。

（来源：医药卫生网）

想爆料？请登录《阳光连线》（ http://minsheng.iqilu.com/）、拨打新闻热线0531-66661234或96678，或登录齐鲁网官方微博（@齐鲁网）提供新闻线索。齐鲁网广告热线0531-81695052，诚邀合作伙伴。